流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测
激活的淋巴细胞内细胞因子的检测

简介

    细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。近来研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
    早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－γ）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
    近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。
    胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。

一、仪器设备
1． 12×75mm有盖的Falcon管（BD Catalog No.2058）
2． 37℃孵箱5％CO2
3． 混匀振荡器
4． 离心机
5． 加样枪、Tips
6． FACS流式细胞仪

二、细胞
1、全血
    使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAINER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)
    使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。

3、 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)
    用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640。

4、 细胞系与T细胞克隆
    调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。

5、冰冻全血与PBMCs
    应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1％的BSA及10％的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液 通透与染色。

三、刺激试剂与抗体
1、PMA（Sigma catalog No.P-8139）
    打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1mg包装的小瓶，打开迅速加入1ml的无水乙醇或DMSO。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1.5ml的e.p.管中,每管10μl,取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。

2、离子霉素Ionomycin(Sigma catalog No.I-0634)
    打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100支1.5ml的e.p.管中，每支10μl，取出1支待用，其余19支冻存于-70℃或-20℃冰箱，

3、Golgistop或Golgiplug,（catalog No.555029或554724）
    详细请见说明书

4、所需相应的抗体，如CD4、CD8、CD3、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、CD69等。
最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血

5、离子霉素：1μg/ml全血

6、FACS溶血素
FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：
(1) 全血制备时用于溶解红细胞
(2) 固定外表位
(3) 辅助通透剂
    FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。

7、FACS通透液
    BD推出FACS通透液（BDIS Catalog No.340973）以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。
    FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。

四、对照

    正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。

1、 未刺激对照
    未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与10μg/mLBFA或莫能霉素共孵育，不加刺激剂。

2、 同型对照
    同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗-KLH同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。

3、 激活对照
    激活对照使用细胞表面表达CD69 来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a. 取部分血样加PMA+I但是不加莫能霉素或BFA（抑分泌试剂如BFA会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测）。
b. 表面染色CD69PE/CD3PerCP，省略通透与胞内染色步骤。
c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，表面CD69染色阳性率应在90%以上。

4、 胞内染色对照
    胞内染色对照通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a. 取部分血样加PMA+I+Golgistop
b. 省略表面染色，胞内染色CD69PE/CD3PerCP（BDIS Cat.No.340368）
c. 以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，胞内CD69染色阳性率应在90%以上。

五、样品的激活与染色：（以Th1和Th2的检测为例）

    激活时由于莫能霉素的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含莫能霉素。激活过程在有盖的Falcon管中进行。

1、 取五支有盖的Falcon管，编号1、2、3、4、5，前四支为对照，第五支是样品检测管，分别取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 X 106 ）500μl，加入500μl RPMI1640进行稀释一倍，每支管中加入上述刺激剂，混匀。
最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血
离子霉素：1μg/ml全血
BFA：10μg/ml全血
莫能霉素:3μm/ml全血
2、37 0C，5%CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖)
3、取出Falcon管，用PBS洗两遍，1200转，离心5分钟。慢慢吸出上清。
4、胞外染色：1、2、5管中加入20μl 如CD3、D4-PerCP,3管加入 CD69-PE+CD3-PerCP抗体混匀，室温避光15分钟。
5、溶血：每管加入10X的溶血素2ml，室温避光10分钟。取出，1200转，离心5分钟。弃上清。
6、破膜通透：3、管省去破膜通透及胞内染色。1、2、4、5管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2ml含0.5BSA的PBS，1000转，离心5分钟。弃上清。
7、胞内染色：1、2、4、5管中加入上表内的抗体。混匀，室温避光30分钟。加入2ml含1%BSA的PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。
8、上机检测：加入0.5ml的鞘液，在CellQuest软件下，获取10万个细胞。
    应用BD FACS流式细胞仪分析。
    使用CaliBRITE标准微球，调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度。
    用CellQuest获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10万细胞。
    设门圈定FL3+细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用CellQuest，Attractors分析数据。PMA激活时，血小板可能会被圈在FL3门内，此时可以用FSC/SSC设门。以CD4设阈值时，以FSC/SSC设门可以排除单核细胞。

特异性结果的计算
公式：（AS-AIC）-（US-UIC）
AS： 激活样本
AIC：激活同型对照
US：未刺激样本
UIC：未刺激同型对照