蛋白质功能与折叠原理研究
1、蛋白质二硫键异构酶四个结构域的环形排布及其协同作用
王志珍组
用小角X射线散射(SAXS)技术测定了人蛋白质二硫键异构酶（PDI）在溶液中的结构。这是首次报道的人源PDI 全长分子在溶液中的低分辨率结构。重构模型表明PDI是一个短的椭圆柱体形状的分子，计算分子质量为69 kDa，分子大小为105 × 65 × 40Å。四个具有硫氧还蛋白折叠 ((Trx)-fold) 模式的结构域按a-b-b’-a’顺序以环形的方式排列。原子力显微镜成像结果也表明PDI分子在溶液中大概是一个扁平的椭圆柱体。基于分子筛测定的表观分子质量为116KDa的PDI组分长期被认为是一个同源二体，但是超离心分析的结果表明它实际上是单体。PDI C端的441-491序列可能是造成PDI分子筛行为异常的原因。PDI的环形排布模型诠释了PDI在行使异构酶和分子伴侣活力时四个结构域的相互协同作用。
2、分子伴侣Hsp70通过与不同中间体相互作用抑制α-synuclein形成纤维
王志珍组
α-Synuclein (AS) 是帕金森氏症患者大脑神经元中淀粉样沉淀所形成的包含体－路易氏体的主要成分。我们鉴定到热休克蛋白 Hsp70 至少通过阻止AS 纤维前体的形成、结合 AS 纤维前体阻止 AS“核”形成、结合 AS“核” 抑制 AS 纤维延伸三种作用来抑制 AS 形成纤维；并且抑制 AS 纤维前体所诱导的脂质体通透性的增加。 Hsp70 的底物结合结构域本身已足以抑制 AS 形成纤维，而与 AS 纤维前体结合只需要底物结合亚结构域，但结合 AS“核”则同时需要 C-末端盖状亚结构域和底物结合亚结构域。分子伴侣抑制 AS 形成纤维的研究结果为阐明 AS 形成纤维的机制提供了分子基础，同时也为分子伴侣在许多神经退行性疾病中阻止有关蛋白形成毒性物质的机制提供了分子基础。
3、大肠杆菌DsbC的折叠行为 - 单体折叠中间体的鉴定
王志珍组
通过构建单体和二体突变体，分析盐酸胍诱导的同源二聚体DsbC的去折叠和重折叠的平衡态和动力学的过程。我们监测到DsbC在折叠中的单体中间体。说明DsbC的二体结构和非活性中心二硫键对其结构的稳定和功能的发挥起到重要作用。
4、蛋白质错误折叠与疾病
柯莎组
（1）Ure2 prion化的分子机制：N端和C端结构域分别在prion化中的作用
酵母prion蛋白Ure2在体内和体外都能形成淀粉样结构，其N端的prion结构域（PrD）和C端部分区域被发现在体内能影响Ure2的prion化。为了揭示Ure2 prion化的机制，我们已经研究了一系列PrD缺失的Ure2突变体的性质，发现PrD在纤维化的成核过程中有重要作用，C端区域决定Ure2的折叠性质。我们也进行Ure2折叠的动力学和热力学分析，发现Ure2至少存在三个折叠中间态，目前我们正在研究一系列C端缺失突变体的折叠机制。
（2）Ure2的酶学分析
我们首次证明了天然态和纤维化Ure2都具有谷光甘肽依赖性的过氧化物酶活性。为了进一步发现其反应机制和确认催化活性的必需残基，我们正在进行一系列相关突变体的构建以及功能与结构关系的研究。
（3) 淀粉样聚集物的细胞毒性研究
培养不同种类的哺乳动物细胞，加入天然态Ure2及不同种类的Ure2聚集体，研究Ure2及其成纤维不同阶段聚集体的细胞毒性。原初纤维的细胞毒性最大，其次是成熟纤维，天然态的Ure2几乎没有细胞毒性。分子伴侣对Ure2聚集体细胞毒性的影响正在研究中。
（4）分子伴侣与Ure2的相互作用
在细胞内影响prion化的因素包括分子伴侣Hsp70、Hsp40和Hsp104。这些分子伴侣已被纯化并用于探索他们对Ure2折叠和纤维化的影响。最近的结果表明Hsp40-Ydj1能和Ure2直接相互作用，并且特异性的在Ure2成纤维的早期抑制Ure2的纤维形成。其他分子伴侣Ssa1-Hsp70和Hsp104也能抑制Ure2的纤维形成。
5、蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的NMR研究
王金凤组
（1）确定了一个人源c10orf70 (c10orf70[31-108])蛋白质的三维结构，这是一个相互交叠的二体蛋白，是具有新结构类型的人线粒体的2Fe-2S蛋白。它的Fe-S簇的几何结构以及Fe-S簇结合位的结构不同于其它的已知2Fe-2S蛋白。 经分析c10orf70[31-108])蛋白质可能是一个糖尿病药物Thiazolidinediones (TZDs)在人线粒体中的潜在靶分子。
（2）确定了[P62A]Ssh10b二聚体的三维结构，运用GdmSCN 的变性实验和NMR的H/D交换及蛋白骨架酰氨氮弛豫研究了[P62A]Ssh10b及其突变体热稳定性的结构基础及热稳定性的分子机制。 指出了在桶状疏水核心的疏水堆积与蛋白质中的肽链间和肽段间的氢键以及离子对间的协同相互作用决定了[P62A]Ssh10b的热稳定性，而盐键网中的静电相互作用对蛋白质的高度热稳定性起了关键作用。
（3）研究了金黄色葡萄球菌酶（SNase）的β-与a-亚结构域片段(SNase121与SNasea3片段)在SNase121-SNasea3复合体中的折叠机制及相互识别的机制，确定了SNase121-SNasea3复合体的溶液三维结构,得出了β亚结构域和a亚结构域两个片段在复合体中相互作用，相互诱导，不断地调整结构，最后组装成天然态的酶，说明了在全酶折叠过程中β亚结构域和a亚结构域的折叠有高度地协同性和依赖性。
（4）运用异核多维NMR解析了其它三个人源基因编码蛋白质的三维结构，正在对这些蛋白的相关功能进行研究。正在进行[P62A]Ssh10b-DNA和SNase-DNA复合物的异核多维NMR实验，以最终确定复合物的溶液三维结构。
6、内源NO介导神经元内质网应激的分子机理
陈畅组
建立内外源一氧化氮NO诱导神经细胞内质网应激模型。阐明神经细胞内质网应激过程中NO对功能蛋白的巯基亚硝基化修饰的机理及与细胞氧化还原状态的关系，以及该过程中细胞内氧化应激和亚硝基化应激的时序关系。揭示细胞中重要的控制蛋白合成的细胞器内质网发生应激对神经细胞损伤的新的作用机理，为蛋白沉积类疾病机理提供新线索。为通过监测细胞内总体亚硝基化修饰水平新指标来诊断脑疾病提供理论依据。并进一步研究NO供体S-亚硝酰基谷光甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）的调控机制，为开发新的NO供体类药物奠定基础。
|
