生物膜和膜蛋白功能结构研究

• 1、膜脂－膜蛋白相互作用的研究 （杨福愉组）
• 2、囊泡钙库的动态调节及其与分泌的关系 （徐涛组）
• 3、肌浆网脂筏结构调控肌浆网Ca²⁺-ATPase的功能 （张旭家组）
• 4、蛋白质组学新方法研究与应用 （杨福全组）

1、膜脂－膜蛋白相互作用的研究

杨福愉组

（1）与张旭家合作，研究‘脂筏’对肌浆网膜Ca²⁺-ATP酶（SERCA）和质膜Ca²⁺－ATP酶（PMCA）的影响，‘脂筏’组分－胆固醇、神经鞘脂对SERCA的PMCA活性的影响。对‘脂筏’对NOS基因表达及酶活性的调控作用。

（2）胰凝乳蛋白酶B（CtrB）在溶酶体中的定位及其对细胞凋亡的影响。

一般认为Ctr
B是由胰腺分泌的一种具有消化功能的水解酶，我们发现它也是细胞内溶酶体中的一个成员，在一定条件下可以从溶酶体中泄漏并通过线粒体中介参与细胞凋亡过程。

2006年通过：

① Ctr B在溶酶体中的定位；

② 在TNFα诱发下CtrB从溶酶体移位至细胞质；

③ CtrB水解Bid导致线粒体的释放；

④
如果将CtrB与其抑制剂TPCK同时处理，TNFα诱导细胞凋亡就会显著降低等等都进一步验证细胞中溶酶体CtrB的存在及其参与细胞凋亡的作用。

除此之外CtrB是否对细胞还有其它功能正准备进一步研究。

2、囊泡钙库的动态调节及其与分泌的关系

徐涛组

我们成功的在INS-1细胞上同时检测到[Ca²⁺]_i 和[Ca²⁺]Lu_Lu变化，并通过直接证明用GPN消除酸性钙库后不影响ER钙库内的钙变化过程，证明它们为不同的细胞内器官。

我们进一步研究了胰腺β细胞上酸性囊泡钙库的特性，发现它会在生理条件下激活，因此具有生理意义。例如，我们发现，长时间去极化细胞会导致囊泡钙库的释放，含胰岛素大囊泡与细胞融合后释放出来ATP也会促进囊泡钙库的释放，起一个正反馈的作用。我们同时证明囊泡膜上存在不同的钙释放受体，如IP3受体和NAADP受体等。

研究成果如下：

（1）我们证明外源ATP刺激胰腺β细胞后会促进囊泡通过IP3受体的释放Ca²⁺，从而增强胰岛素分泌，结果发表在Traffic上。

（2）我们证明长时间去极化刺激胰腺β细胞后也可以促进囊泡钙库通过NAADP受体释放Ca²⁺，从而影响葡萄糖刺激后细胞的动作电位振荡和Ca²⁺振荡的动力学，结果也发表在Traffic上。

3、肌浆网脂筏结构调控肌浆网Ca²⁺-ATPase的功能

张旭家组

脂筏结构不仅存在于质膜，在高尔基体、膜蛋白运输通路中的内质网囊泡膜中也有类似的结构微区。肌质网是骨骼肌细胞中特化的内质网，其功能主要在于维持胞内的
Ca²⁺
平衡。我们利用蔗糖密度梯度漂浮的方法，从基本上无质膜和线粒体等细胞器污染的肌质网膜中分离了低密度的，低温下不溶于非离子去垢剂 Triton
X-100 的膜微区，即肌质网膜的不溶于去垢剂的组分 - SRIC，并对其进行了性质的鉴定，发现它富含鞘磷脂和胆固醇，并富集脂筏的标志分子
GM1。Caveolin-3 （Cav-3）是 Caveolae 的结构和标志蛋白，定位于肌细胞的质膜。我们利用免疫荧光显微镜技术，证明
Cav-3 也存在于肌质网膜上。另外免疫印迹的结果显示 Cav-3 在 SRIC
微区中富集。上述结果进一步提示肌质网膜中可能也具有“脂筏”结构。

对肌质网 Ca²⁺-ATPase 蛋白及其活性在膜上的分布情况进行了分析，肌质网 Ca²⁺-ATPase
既存在于 SRIC，又存在于肌质网膜的溶于去垢剂的组分，即 SRSC 微区中，但是只有位于 SRIC 中的肌质网 Ca²⁺-ATPase
才表现出很高的 Ca²⁺ 依赖的 ATP 水解活性和 Ca²⁺ 转运活性，这说明肌质网 Ca²⁺-ATPase
与 SRIC 的结合对于其功能活性是必需的。利用不同的去垢剂，CHAPS 和 OG 溶解肌质网膜，不同去垢剂提取的 SRIC
结构组成并不等同，但均支持肌质网 Ca²⁺-ATPase 只有与 SRIC 结构结合，才具有功能活性。用 MβCD
去除肌质网膜的胆固醇，破坏了 SRIC 结构，使得分布于 SRIC 组分的肌质网 Ca²⁺-ATPase 移向
SRSC，并导致酶活力的丧失。以上结果提示肌质网膜中的“脂筏”结构对 Ca²⁺-ATPase活性的表现具有重要的作用。

4、蛋白质组学新方法研究与应用

杨福全组

（1）研制了新型一维、二维高效毛细管液相色谱柱，设计加工了液-质联用接口平台，建立了经济、高灵敏和高通量的多维蛋白质鉴定系统，并成功应用于蛋白质复合体的鉴定以及蛋白质组学研究。

（2）以大鼠线粒体膜蛋白为研究对象，选择和优化了膜蛋白的溶解、富集和酶解的最佳条件，建立了膜蛋白质组学技术平台，并成功应用于：大鼠b细胞中胰岛素储存囊泡蛋白质组分析；人NK细胞中溶酶体的蛋白质组分析；小鼠肝脏中脂滴蛋白质组分析；GSV分泌相关的蛋白质复合体的分析鉴定。

（3）建立了基于SILAC定量蛋白质组学技术方法，成功应用于：L6骨骼肌细胞分化前后蛋白质表达差异分析；Insulin对L6肌管细胞长效作用前后蛋白质表达差异分析等。

（4）开展了磷酸化蛋白质组学新技术新方法的研究与应用。

（5）开展了肿瘤死亡预警蛋白生物标志物、白血病相关蛋白生物标志物的分离鉴定工作，并取得重要进展。

（6）完成了微型逆流色谱仪及液-质联用接口的研制，并初步开展了人类血清肽组学的研究。